ABSTRACT
Human neutrophils stimulated by phorbol myristate acetate (PMA), an activator of protein kinase C, produce active oxygen by NADPH oxidase in intracellular structures. We added succinimidyl ester of dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA), which first emits fluorescence when oxidized with active oxygen species, to neutrophils to produce active oxygen, in order to investigate the antioxidant effects of protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid which belong to polyphenols and are widely distributed among plants. Particularly, we focused on examining whether these substances capture and eliminate active oxygen inside or outside the neutrophil cytoplasm and whether these substances inhibit NADPH oxidase. Fluorescence microscopy demonstrated that fluorescence-positive intracellular structures were decreased in neutrophils when stimulated by PMA and exposed to an antioxidant. Quantitative measurement by flow cytometry revealed that the fluorescence intensities in neutrophils, exposed to protocatechuic acid, ferulic acid, or caffeic acid, were decreased by 62.9 percent, 71.4 percent, and 86.1 percent, respectively, as compared with those stimulated by PMA but not exposed to an antioxidant. Judging from fluorescence microscopy and dot blots by flow cytometry, these antioxidants had no effects on neutrophil morphology. On the other hand, the fluorescence intensities of the active oxygen released from neutrophils were decreased by 81.4 percent, 46.7 percent, and 27.4 percent, respectively. Diphenylene iodonium, a specific inhibitor of NADPH oxidase, inhibited the enzyme by 92.1 percent in the PMA-stimulated neutrophils. Protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid inhibited the enzyme by 36.5 percent, 54.6 percent, and 27.4 percent, respectively. These results demonstrate that protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid capture and eliminate active oxygen, produced by PMA-stimulated neutrophils, intracellularly and extracellularly. Furthe...
Los neutrófilos humanos estimulados por forbol-miristato-acetato (PMA), un activador de la proteína quinasa C, producen oxígeno activo por la NADPH oxidasa en las estructuras intracelulares. Hemos añadido diacetato de 2', 7-dihidro dicloro fluoresceína (H2DCFDA), que emite fluorescencia cuando se oxida con las especies de oxígeno activo, a neutrófilos para producir oxígeno activo, a fin de investigar el efecto antioxidante del ácido protocatéquico, el ácido ferúlico y el ácido cafeico que pertenecen a polifenoles y se distribuyen ampliamente entre las plantas. Particularmente, nos enfocamos en examinar si estas sustancias capturan y eliminan el oxígeno activo dentro o fuera del citoplasma de neutrófilos y si estas sustancias inhiben la NADPH oxidasa. La microscopia de fluorescencia demostró que las estructuras intracelulares positivas a fluorescencia disminuyeron en los neutrófilos mediante la estimulación de la PMA y exposición a un antioxidante. La medición cuantitativa por citometría de flujo reveló que la intensidad de fluorescencia en los neutrófilos, expuestos al ácido protocatéquico, el ácido ferúlico, o el ácido cafeico, se redujo un 62,9 por ciento, 71,4 por ciento y 86,1 por ciento, respectivamente, en comparación con las estimuladas por PMA pero no expuestas a un antioxidante. A juzgar desde la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo, estos antioxidantes no tuvieron efectos sobre la morfología de los neutrófilos. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia del oxígeno activo liberado por los neutrófilos se redujeron un 81,4 por ciento, 46,7 por ciento y 27,4 por ciento, respectivamente. El DPI (difenileno-iodonio), un inhibidor específico de la NADPH oxidasa, inhibió a la enzima en el 92,1 por ciento en los neutrófilos estimulados por PMA. El ácido protocatéquico, el ácido ferúlico y el ácido caféico inhiben la enzima en un 36,5 por ciento, 54,6 por ciento y 27,4 por ciento, respectivamente. Estos resultados demuestran...